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避免熒光串色的方法

發布時間:2020/3/11 點擊量:183

避免熒光串色的方法

    在用熒光顯微鏡對樣品進行觀察時,兩種或兩種以上熒光素之間,如果熒光發射峰很近,那麽熒光光譜彼此會有部分重疊,檢測到可能出現一種熒光素的信號擴散到另一熒光通道的情況。這種現象稱為串色或熒光光譜交叉(crosstalk)。避免或排除光譜交叉幹擾的方法通常有以下幾種:
    1)使用幾種熒光素時,盡量選擇之間無光譜交叉的熒光素。
    2)降低標記熒光強度:樣品的一種或幾種熒光強度太高,有時會導致光譜交叉出現。采用降低標記物濃度、縮短標記時間及調整熒光素介質等方法可降低樣品熒光強度。
    3)采用序列掃描方法:主要是指用不同波長激光輪流照射樣品,同時在相應的熒光檢測通道輪流采集,並顯示每種熒光的共聚焦圖像。對於雙重熒光染色樣品其具體操作過程時:首先隻用一種激光激發相應的di一種熒光物質,在di一通道顯示其熒光圖像;再用另一種激光激發另一種熒光物質,在第二通道顯示其熒光圖像。相應的順序掃描軟件能夠將兩通道的不同熒光圖像同時分通道顯示並疊加合成,展示出兩次熒光間空間定位關係。以此類推,用順序掃描方法還可以采集三重或更多重熒光樣品的圖像。
    4)修改光譜檢測的檢測條件:在圖像上出現比較弱的熒光交叉信號時,可通過改變儀器的檢測條件來克服,常用的措施有:
    a.降低幹擾熒光的激發強度以降低其發射熒光強度;
    b.減小被幹擾通道的檢測靈敏度;
    c.改變激發光波長和檢測波長範圍等。例如在熒光通道2的圖像上看到來自通道1的較弱的熒光交叉信號,這時,在保證采集到各通道清晰圖像的情況下,降低通道1的激發強度,減小通道2的光電倍增管效能以降低其采集的靈敏度,小範圍內改變各通道的檢測波長,可以消除來自通道1的熒光交叉信號。
    5)熒光光譜鑒別法:通常情況下,不同熒光物質的熒光光譜不會完全重疊,利用不同熒光光譜之間的差異,可以將來自兩種熒光物質的熒光信號鑒別開來,得到各自的熒光圖像。

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